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박성관샘! DNA와 히스톤단백질 분리에 관해 알아본 내용입니다.

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작성자 고은주 작성일11-11-17 14:23 조회7,718회 댓글0건

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결론부터 말씀드리면 진핵생물의 DNA는 히스톤단백질과 분리됩니다.


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원핵생물의 DNA는 원래 히스톤단백질이 없는 고리모양의 DNA이구요.


 


DNA로부터 단백질을 제거하는 기술이 게놈프로젝트를 가능하게 하였더군요.


 


 


아래 자료는 참고하시라고 덧붙입니다.


 


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1.


 


세포라는 가장 작은 소기관내에 인이라는 동그란 구형안에 DNA는 당과 단백질이 단추역할처럼 후크를 만들어 팩킹되어 안전하게 보존되어 있다가, 필요시에는 빠르게 풀려나와 mRNA를 만들고, 다음에는 단백질을 만들어서 뼈를 만드는 등, 활동에 필요한 기능을 할 수 있습니다.


 


 


첫번째 , 동물은 세포벽내에, 식물은 이중 세포막내에 '인'이라는 소기관에 있는 감추어져 있는 DNA를 분리하기 위해서 먼저 식물 또는 동물을 조직이 손상되지 않게 빠르고 곱게 마쇄하여 세포들을 DNA 추출용액에 나출합니다.


 



 


두번째 단계는, 나출된 세포의 구조를 파괴해야하는데, 주로 고농도의 염기와 가수분해효소 성분을 사용합니다. 그 대표적인 화학성분이 NaCl과 Sodium dedoxyl sulfate (SDS) 입니다.


 


세번째 단계는, DNA 팩킹에 참여하는 다당류(폴리사카라이드)와 단백질을 떼어내는 과정입니다.


 



 


주로, 히스톤이라는 단추 역할의 단백질을 제거하기 위해서는 페놀(phenol)을, 다당류를 제거하는데는 클로로폼(chlorofom)을 사용합니다.


 



 


네번째 단계는 DNA 추출 용액으로 용해되어 나온 DNA와 DNA가 담아져 있던 세포찌꺼기들 그리고 분리에 활용한 페놀 클로로폼 등과의 구분을 위해서, 고속으로 원심분리를 합니다. (찌꺼기와 페놀, 클로로폼은 아래층으로, DNA가 용해된 용액은 윗층으로 구분되어 집니다.)


 



 


다섯번째 단계는 DNA가 용해되어 있는 상층액만 다른 튜브로 옮겨서 '음이온친화도' 원리에 따라, 10% 염기와 알코올 성분으로 빠르게 DNA 추출 용액에 있던 H2O분자들이 결합을 하게되어, DNA는 용액내에서 서로 엉킹채로 떠다니게 됩니다 (갑자기 친구였던 H2O가 더 사랑하는 염기와 알콜 성분을 가진 애인들한테 가버리는 현상이 일어나죠.).


여섯번째 단계는, 이렇게 짝을 잃고 유리하는 DNA를 유리 파스테르관으로 건져 올린 후에 잘 건조하고, DNA가 안전하게 보존될 수 있는 용액에 다시 녹인 후, 필요한 과학 실험에 이용할 수 있습니다..


 


 


가장 쉽게 DNA 분리하는 방법을 농진청 100주년 행사에서 소개 했었는데요..


 


그 방법을 소개하면..


 


1. 키위를 강판에 간다(첫번째 단계)


 


2. 키위간것을 유리컵에 넣고 소금과 트리오를 넣어준다 (두번째, 세번째 단계)


 


3. 거름망에 위의 섞은것을 걸른다 (네번째 단계)


 


4. 알코올을 넣는다 (다섯번째 단계)


 


5. 하얗게 엉기는 덩어리를 건져 올린다. (여섯번째 단계)


 


출처: 여성농업인신문 http://women.nongupin.co.kr/bbs/list.html?idxno=201&table=bbs_7


 


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2.


 


이런 원리를 이용해서 DNA에서 단백질을 제거해낼 수 있고 단백질이 제거된 DNA를 원하는 조각으로 잘라낸 다음 단일가닥으로 풀어내어 이에 상보적인 염기서열을 가지는 DNA절편의 유무를 검정해내는 실험에 이용하고 있습니다. 이것이 서던블로팅이라고 부르는 서던블랏 실험인데요. 서던 블랏 실험시엔 DNA 는 단백질과 분리됩니다. 따라서 탐침이 자유롭게 붙죠.


 


서던 블로팅은 생물체의 DNA 게놈에서 관심대상인 특정 DNA 절편의 유무를 검정하기 위한 기법이다.


 


생물체의 DNA 게놈을 특정 제한효소로 절단하면 다양한 크기의 수많은 DNA 절편이 만들어지는데, 사람의 경우 약 300만 개 정도가 나타난다. 서던 블로팅 기법은 바로 수백만 개의 DNA 절편 중에서 관심있는 특정 DNA 절편의 존재를 검색하는 방법으로 그 절차는 ① 제한효소에 의한 DNA의 절단, ② 아가로스 겔(agarose gel) 전기이동에 의해 절단된 DNA 절편의 크기에 따른 분획, ③ 겔 내부에 있는 이중나선 DNA를 단일나선으로의 변성, ④ 니트로셀룰로오스막(nitrocellulose membrane/NC membrane)으로 겔 내부의 단일나선 DNA의 전이(이 과정을 'blotting' 또는 'transfer'라고 하며, 이때 막의 동일한 위치에 DNA 절편이 존재), ⑤ 관심대상 DNA의 전부 또는 일부의 절편에 방사성동위원소로 표지하여 DNA 탐침의 조제 및 단일나선으로의 변성, ⑥ 니트로셀룰로오스막의 DNA와 DNA 탐침과의 DNA-DNA 잡종형성 반응(이때 막에 있는 DNA에 DNA 탐침이 상보적으로 결합), ⑦ 마지막으로 X선 필름에 NC 필터를 자기방사법에 의해 감광시킴으로써 특정 DNA의 존재 및 위치 확인 등의 순서로 되어 있다. 이 기법은 1975년 E.M. 서던이 개발하여 처음으로 소개했기 때문에 그의 이름을 따서 '서던 블로팅'이라 명명했다. 이 기법은 초기에 DNA 게놈에서 어느 특정 DNA 절편의 확인을 위해 주로 사용했으나, 현재는 플라스미드·코스미드·박테리오파지 등의 DNA를 탐색하는 데도 널리 이용되고 있다.


출처 : 다음 백과사전 http://100.daum.net/encyclopedia/view.do?docid=b11s3467a


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3.


게놈DNA는 긴 이중사슬로 세포 핵 내에 존재하고 있다. 게놈 DNA추출에 있어서는


어떠한 방법으로 파손시키지 않고 추출해서 어떻게 정제도가 높은 것을 얻는지가 중요하며, 이러한 요건을 만족시키는지의 여부에 의해 그 후의 DNA분석의 성패가 결정된다.


DNA의 추출은 먼저 세포를 용해하고 세포 내의 DNA를 가용화한다. 이어서 DNA에 결합하고 있는 히스톤 등의 단백질을 K라는 단백 분해효소를 이용하여 제거한다. 그리고 용매인 페놀․클로로포름을 DNA용액에 첨가하여 DNA용액 중의 단백질을 변성시켜 제거한다. 클로로포름은 지질제거에도 효과적이다. 또 RNA분해효소인 Rnase를 사용하여 DNA 용액 중에 혼재하고 있는 RNA를 분해, 제거한다. 그 후 다시 페놀․클로로포름 처리한 후, DNA용액 중에 초산나트륨과 에탄올을 가하여 냉각시키면 DNA는 침전되고(에탄올 침전법) 원심분리하면 pellet으로 회수할 수 있다. 이렇게 DNA 추출의 주된 조작은 제단백이라는 것이 된다. 더욱이 DNA추출을 통해서 DNADP 물리적인 절단이 되지 않도록 하는 것이 중요하다.


 


출처 : 『시로 쓰는 이중나선,민경대 외 지음, 살림터, p302


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